潑尼松ELISA檢測試劑盒

（豬牛羊組織專用）使用說明書

【測定原理】

        本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物潑尼松將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗潑尼松抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物潑尼松的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應殘留物潑尼松的含量。

【試劑盒技術(shù)指標】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

組織 ………………………………………0.3ppb

交叉反應率：

潑尼松……………………………………100%

樣本回收率：

組織 …………………………………85%±10%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶標記物       7ml………………………紅色帽

4、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

5、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

6、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

7、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

8、 10X濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

9、 2X 濃縮復溶液  50ml ·………………  藍色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、

振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl

（2）試劑：乙腈、正己烷、氯化鈉

【實驗前溶液配制】

配液1、2×復溶液：

                將2×濃縮復溶液用去離子水以1：1稀釋（1份1×濃縮復溶液+1份去離子水），用于樣本提取和稀釋。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（10倍濃縮）用去離子水按照 1：9稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

樣本前處理須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒適用于檢測豬牛羊組織樣本。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（A）  組織樣本處理方法

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取3±0.05g樣本于50ml離心管中，加入1g氯化鈉，再加入6ml乙腈，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上,室溫離心5分鐘；

2、 取上清液2ml至干凈玻璃試管中，于65℃水浴下氮氣/空氣吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml配好的1×復溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心3分鐘。

4、 取50 µl下層清亮液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1  

【酶標免疫分析程序】

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境避光反應30分鐘。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物A液50ul，再加底物B液50ul，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含潑尼松的含量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

     用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.810；0.1ppb為1.450；0.3ppb為1.090；0.9ppb為0.720；2.7ppb為0.369；8.1ppb為0.208。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中潑尼松實際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以金剛烷胺濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中金剛烷胺實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）   

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

                 0.1                 0.3                 0.9                2.7                 8.1                   

        潑尼松(ppb) [µg/kg]

圖1：潑尼松檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

       0       0.1      0.3            0.9          2.7           8.1       

潑尼松(ppb) [µg/kg]

圖2：潑尼松檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出潑尼松檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應潑尼松濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、批號見外包裝。